المحتوى
وصمة عار الجرام هي عملية تلطيخ تفاضلي تظهر البكتيريا إيجابية الجرام أو سلبية الجرام بناءً على لونها المصبوغ. كحول الأسيتون هو أحد الكواشف المستخدمة في هذه العملية لتوفير تمايز اللون. تحتوي البكتيريا الموجبة للجرام على طبقة ببتيدوغليكان سميكة وأرجوانية وصمة عار ، في حين أن الكائنات الحية الدقيقة سالبة الجرام تحتوي على طبقة ببتيدوغليكان قليلة اللون وبدون بقع وردية اللون.
الابتدائي وصمة عار كريستال البنفسجي
بمجرد تحضير شريحة من العينة البكتيرية ، يتم استخدام اللون البنفسجي البلوري لصبغ العينة أولاً. عند هذه النقطة ، ستظهر البكتيريا إيجابية الجرام وسالبة الجرام باللون الأرجواني. عادة ما يتم استخدام اللون البنفسجي البلوري على الشريحة لمدة 30 ثانية قبل غسل أي بقعة زائدة بالماء. يمكن للأشعة فوق البنفسجية الكريستالية أن تلتصق قليلاً بطبقات الببتيدوغليكان ، لذا لن يتم غسل البقع الأساسية بالماء.
لاذع-اليود
ثم يضاف اليود إلى العينة لمدة دقيقة واحدة. إنه يعمل كمورد ، والذي يعمل على إصلاح الأصباغ في عملية تلطيخ. يؤدي اليود هذه الوظيفة عن طريق الارتباط بالبنفسج البلوري وخلق مركب غير قابل للذوبان يلتصق بشكل أفضل بالطبقة الببتيدوغليكية السميكة الموجودة في الخلايا البكتيرية الموجبة للجرام مقارنة بالبنفسجي البلوري وحده. لا توجد خطوة غسل بالماء بعد إضافة اليود.
مزيل اللون كحول
يمكن استخدام إما أسيتون أو كحول الإيثيل كعامل لإزالة اللون. يذوب الكحول الدهون الموجودة في غشاء الخلية الخارجي للبكتيريا سالبة الجرام ، مما يسمح لمركب اليود البنفسجي البلوري بالتسرب من الطبقة الببتيدوغليكان الرقيقة. يضاف الكحول لمدة 10 إلى 20 ثانية ؛ يتم سكبها على الشريحة حتى يتم غسل كل اليود بعيدًا ويصبح جريان الماء عديم اللون. في هذه المرحلة من عملية صبغة الجرام ، تكون البكتيريا سالبة الجرام عديمة اللون بينما لا تزال البكتيريا الموجبة للجرام تحتفظ بنفسجي. بمجرد الانتهاء من الشريحة ، يجب شطفها بالماء لإيقاف تأثير إزالة اللون.
مباين-سفرانين
يضاف بعد ذلك Safranin لزيادة الرؤية والتناقض مع البكتيريا سالبة الجرام عديم اللون. وصمة عار يجعل هذه البكتيريا تظهر الوردي تحت المجهر. نظرًا لأن البقعة تضاف إلى العينة بأكملها ، فإنها تلطخ أيضًا بكتيريا إيجابية الجرام أيضًا ، ولكن اللون الداكن البنفسجي البلوري يخفي اللون الوردي السافران الأخف وزناً. بمجرد غمر عينة الشريحة بالسافران لمدة دقيقة تقريبًا ، يتم استخدام الماء لغسل أي وصمة عار زائدة لا تلتصق بالخلايا البكتيرية.