المحتوى
يتم تشفير اللون الأزرق الوراثي للخلية ضمن مادتها الوراثية ، أو الحمض النووي. نظرًا لأن الحمض النووي لا يترك أبدًا نواة الخلية ، ولكي تصل هذه المعلومات إلى السيتوبلازم حيث توجد البروتينات والمكونات الكيميائية الحيوية الأخرى ، من الضروري أولاً نسخ الحمض النووي إلى الحمض النووي الريبي messenger RNA (mRNA أو poly (A) RNA). ثم يصبح هذا الحمض النووي الريبي مترجمًا إلى بروتينات تقوم بالعديد من وظائف الخلية. لاكتشاف أو تحديد حجم الرنا المرسال نادر الحدوث ، أو إجراء تحقيقات في المصفوفات الدقيقة أو إنشاء مكتبات من جزيئات الحمض النووي التكميلي ، يجب عزل الرنا المرسال. ومع ذلك ، فإن الحمض النووي الريبي الكلي (أي كل الحمض النووي الريبي في الخلية) واستخراج الرنا المرسال اللاحق لا يمثلان عمليات حصرية بشكل متبادل ؛ يجب أن يتم تنفيذ السابق من أجل استخراج مرنا.
عزل مرنا من الحمض النووي الريبي الكلي
التجانس TRIzol: يشمل الحمض النووي الريبي الكامل جميع الحمض النووي الريبي ، نقل الحمض النووي الريبي ، الريبوسوم الحمض النووي الريبي ، وغيرها من الحمض النووي الريبي غير المشفر. لفصل هذه المكونات عن المكونات الخلوية الأخرى ، يتم فتح الخلية أولاً لتحرير محتوياتها. يتم ذلك عن طريق إعادة تعليق الخلايا المكعبة بواسطة الطرد المركزي (الدوران بسرعات عالية) في TRIzol Reagent (تقنيات الحياة). تعمل إصدارات أخرى من TRIzol (مثل Ambion’s TRI Reagent) بشكل مشابه.
عزل الحمض النووي الريبي الكلي: يتم استخدام سلسلة من أجهزة الطرد المركزي لفصل المكونات المختلفة (البروتينات ، الحمض النووي ، الحمض النووي الريبي) للخلية إلى طبقات ، أو مراحل ، داخل التعليق. يتكون الجزء العلوي ذو اللون الأصفر من الدهون ويمكن التخلص منه. المرحلة المطلوبة باللون الأحمر ، وتحتوي على الحمض النووي الريبي الكلي ويتم الاحتفاظ بها. بعد إجراء استخراج فينول كلوروفورم وسلسلة من غسولات الكحول باستخدام الأيزوبروبانول والإيثانول ، يمكن تكوير الحمض النووي الريبي لعزل مرنا. إضافة مثبطات RNase لمنع هذا الانزيم من تحطيم الحمض النووي الريبي الكلي.
استخراج mRNA: من الشائع استخدام مجموعة لعزل mRNAs ، لأن بروتوكولات المختبر محلية الصنع لا تولد كميات كبيرة من mRNAs عالي النقاء. تشتمل المجموعات التجارية على Invitrogen’s FastTrack 2.0 أو Ambion’s Poly (A) Pure mRNA Isolation Kit. هذه الخطوات الأساسية شائعة في هذه المجموعات:
أ) مزج المخزن المؤقت لتحلل RNase المانع في العدة مع ما يصل إلى 300 ميكروليتر من الحمض النووي الريبي الكلي.
ب) تسخن لمدة 5 دقائق عند 65 درجة مئوية ثم تبرد العينة على الفور لمدة دقيقة واحدة.
ج) قم بمزج هذا مع كلوريد الصوديوم 0.5 م ثم قم بحل Oligo dT بالكامل (حمض oligodeoxythymidylic) في هذه العينة.
د) أجهزة الطرد المركزي هذه العينة واسترداد طاف ، والتي يتم غسلها عدة مرات في سلسلة من مخازن عازلة ملزمة منخفضة الملح المنصوص عليها في مجموعات.
هـ) أزل مرنا عدة مرات حتى يتم الحصول على وحدة تخزين محددة (مثل 500 ميكرولتر).
و) يعجل شطف بواسطة خلات الصوديوم وهطول الأمطار الإيثانول. أعد تعليق ما يصل إلى 20 ميكرولتر من الماء المعالج بثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC).
ز) تخزين في -80 درجة مئوية والتحقق من الجودة والكمية من قبل الطيفية.