المحتوى
- تقييد الانزيمات ومواقع تقييد
- الاتجاه الصحيح
- Ligating لزجة ينتهي يتطلب الحمض النووي أقل
- إنزيمات مختلفة يمكن أن تعطي نفس اللزجة
يعتبر الاستنساخ الجزيئي طريقة شائعة للتكنولوجيا الحيوية يجب أن يكون كل طالب وباحث على دراية بها. يسمى الاستنساخ الجزيئي باستخدام نوع من الإنزيمات يسمى إنزيم التقييد لتقطيع الحمض النووي البشري إلى أجزاء يمكن بعد ذلك إدخالها في DNA البلازميدي لخلية بكتيرية. إنزيمات التقييد تقطع الدنا المزدوج تقطعت به السبل في النصف. اعتمادًا على إنزيم التقييد ، يمكن أن ينتج عن القطع إما نهاية لاصقة أو نهاية حادة. النهايات اللاصقة أكثر فائدة في الاستنساخ الجزيئي لأنها تضمن إدخال جزء الحمض النووي البشري في البلازميد في الاتجاه الصحيح. تتطلب عملية الربط ، أو دمج أجزاء الحمض النووي ، كمية أقل من الحمض النووي عندما يكون للحمض نهايات لزجة. أخيرًا ، يمكن أن تنتج إنزيمات تقييد نهاية اللزوجة نفس النهاية اللزجة ، على الرغم من أن كل إنزيم يتعرف على تسلسل تقييد مختلف. هذا يزيد من احتمالية قطع منطقة الحمض النووي ذات الاهتمام عن طريق إنزيمات نهاية لزجة.
تقييد الانزيمات ومواقع تقييد
إنزيمات التقييد هي إنزيمات تقطع تسلسلات محددة على الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل وتقطع الحمض النووي إلى النصف عند هذا التسلسل. يسمى التسلسل المعترف به موقع التقييد. تسمى إنزيمات التقييد بالنوى الداخلية لأنها تقطع الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل ، وهو كيف يوجد الحمض النووي عادة ، في المواقع التي تقع بين نهايات الحمض النووي. هناك أكثر من 90 إنزيمات تقييد مختلفة. كل يعترف موقع تقييد متميزة. تقوم إنزيمات التقييد بتثبيط مواقع التقييد الخاصة بها 5000 مرة أكثر كفاءة من المواقع الأخرى التي لا يتعرفون عليها.
الاتجاه الصحيح
إنزيمات التقييد تأتي في فئتين عامتين. إما أنها تقطع الحمض النووي إلى نهايات لزجة أو نهايات حادة. تشتمل النهاية اللزجة على منطقة قصيرة من النيوكليوتيدات ، وهي اللبنات الأساسية للحمض النووي ، وهي غير مجحفة. وتسمى هذه المنطقة غير المقيدة بالمتراكمة. ويقال إن المتراكمة تكون لزجة لأنه يريد وسيزوج مع نهاية لزجة أخرى لديها تسلسل تراكب مكملة. النهايات اللاصقة تشبه التوائم المفقودة منذ فترة طويلة والتي تسعى إلى عناق بعضهما البعض بإحكام بمجرد لقائهما. من ناحية أخرى ، النهايات الحادة ليست لزجة لأن كل النوكليوتيدات مقترنة بالفعل بين شقين من الحمض النووي. ميزة النهايات اللاصقة هي أن جزءًا من الحمض النووي البشري لا يمكن أن يصلح إلا للبلازميد البكتيري في اتجاه واحد. في المقابل ، إذا كان لكل من الحمض النووي DNA والبلازميد البكتيري نهايات حادة ، فيمكن إدراج الحمض النووي البشري من الذيل إلى الذيل أو الذيل إلى الرأس في البلازميد.
Ligating لزجة ينتهي يتطلب الحمض النووي أقل
على الرغم من أن الحمض النووي ذو الأطراف اللاصقة يكون لديه وقت أسهل في العثور على بعضه البعض بسبب "الالتصاق بهم" ، فلا يمكن للنهايات اللاصقة ولا النهايات الحادة أن تندمج معًا في قطعة مستمرة من الحمض النووي. يتطلب تكوين قطعة متواصلة من الحمض النووي مرتبطة بشكل كامل إنزيمًا يسمى ligase. تربط الأضلاع العمود الفقري للنيوكليوتيدات عند الأطراف اللزجة أو الشفافة ، مما يؤدي إلى سلسلة متواصلة من النيوكليوتيدات. لأن الأطراف اللاصقة تجد بعضها البعض بشكل أسرع بسبب جاذبيتها لبعضها البعض ، فإن عملية الربط تتطلب الحمض النووي البشري أقل والحمض النووي البلازميد أقل. من غير المرجح أن يجد الطرفان النشطان للحمض النووي والبلازميدات بعضهما البعض ، وبالتالي فإن ربط الأطراف غير الواضحة يتطلب وضع المزيد من الحمض النووي في أنبوب الاختبار.
إنزيمات مختلفة يمكن أن تعطي نفس اللزجة
توجد مواقع التقييد في جميع أنحاء جينوم الكائنات الحية ، ولكنها ليست متباعدة بشكل متساوٍ. في البلازميدات ، يمكن تصميمها بحيث تكون موجودة بجوار بعضها البعض. يجب أن يجد العلماء الذين يرغبون في قطع جزء من الحمض النووي البشري من الجينوم البشري مواقع تقييد أمام وأمام المنطقة. بالإضافة إلى التأكد من إدراج جزء من الحمض النووي في الاتجاه الصحيح ، يمكن لأنزيمات نهاية لزجة مختلفة إنشاء نفس النهاية اللزجة على الرغم من أنها تتعرف على تسلسلات تقييد مختلفة. على سبيل المثال ، تحتوي BamHI و BglII و Sau3A على تسلسلات مختلفة للاعتراف ولكنها تنتج نفس نهاية لاصقة GATC. هذا يزيد من احتمال وجود مواقع تقييد نهاية لزجة التي تحيط الجينات البشرية الخاصة بك من الاهتمام.